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平贝母的研究概况

  平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim)也称平贝、北贝、贝母,为百合科多年生草本植物。平贝母的干燥鳞茎,是我国常用的中药材。野生平贝母主产于黑龙江、辽宁、吉林等地区,山西、陕西、河北等地亦有引种,但目前商品多为栽培品。贝母的应用早在秦汉时期《神农本草经》中就有记载,将其列为中品,是中医止咳祛痰的常用药。《唐本草》、《本草纲目》等医药著作对贝母的功效均有记载。19世纪中期,东北的汉、朝、满、回等民族即有“贝母梨”治疗肺热咳喘等民间验方流传[1]。近年来,从平贝母中提取了各种生物碱及其他化学成分,经研究表明具有清热润肺、化痰止咳、散结等功能,在临床上用于痰热咳嗽、咳痰带血、瘰疬疮疡肿毒等疾病的治疗。平贝与川贝母在化学成分及功效等方面几乎相似,而川贝母资源较少,所以平贝母常作为川贝母的代用品进入国内药材市场,供各地药用,并已被收载于2000年《中华人民共和国药典》[2]中。由于长期对野生药材不注意保护,野生贝母资源不断遭到破坏,1992年《中国植物红皮书——稀有濒危植物》已经将平贝母列入其中[3]。


  1 平贝母的化学成分


  平贝母主产东北,主要有效成分为甾体生物碱类,目前已知的有20种单体生物碱。徐东铭等从平贝母鳞茎中分离和鉴定出6种化合物,即西贝素(imperialine)、贝母辛(peimissine)、平贝碱甲(pingbeimin A)、平贝碱乙(pingbeimin B)、西贝素苷(imperialine-e-β-D-glocoside)和平贝碱苷(petilinineglucoside)。Kitamura和Yukie等学者先后从平贝母中分离出6种生物碱:乌苏里宁(ussurienine)、乌苏里啶(ussuriedine)、乌苏里啶酮(ussuriedinone)、乌苏里酮(ussurienone)、平贝酮(pingbeinone)和黑龙贝母碱(heilonine);平贝母花中主要含有3种生物碱,分别确定为平贝碱甲、贝母辛、贝母甲素[4]。平贝母茎叶中含有贝母辛、平贝碱甲和贝母甲素(peimine)、平贝啶苷(pingbeidioside)、平贝碱乙、平贝碱丙(pingbeimin C)和平贝宁苷(pingbeinoside)等[5]。


  2 贝母碱的测定方法


  检测生物碱的传统方法比较多,如酸碱滴定法、安培滴定法、两相滴定法[6]等。这些方法普遍适用于生物碱的检测,所以它们被用于估计贝母总碱的粗略含量。


  2.1 分光光度检测法 又称酸性染料比色法,根据酸性染料溴麝香草酚蓝在pH=5.0的缓冲溶液中与贝母生物碱形成黄色离子对,此离子对被氯仿萃取后,采用分光光度计在415nm附近测定吸光度,用最小二乘法建立回归方程,由此测定生物碱含量。该方法可消除两相滴定法因终点观察困难所带来的误差,也不需要昂贵的检测仪器,是目前测定贝母生物碱类最为常用、可靠的方法。李萍等[7]采用酸性染料比色法,以去氢贝母碱为参照物,在410nm波长下测定了川贝母、浙贝母、湖北贝母和平贝母等21种贝母中的总生物碱含量。该方法灵敏、快速。


  2.2 薄层扫描法(TLCS) 这是目前测定贝母单体生物碱最常用的方法。主要有:单波长薄层色谱法、双波长薄层扫描法、薄层-导数荧光分光光度法以及微乳薄层色谱法,最常用的是双波长扫描法。薄层板为硅胶G板,展开剂基本为3个系统,即乙酸乙酯-甲醇-氨水系统,苯(环己烷)-乙酸乙酯-二乙胺系统和乙醚-无水乙醇系统。薄层板以改良碘化铋钾喷雾显色,测定波长495~540nm,参比波长600~650nm。可用薄层扫描法定量的单体生物碱有西贝素、平贝碱甲、平贝碱乙、贝母辛、贝母甲素等。李萍等[8]曾在硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1)为展开剂,采用改良碘化铋钾试剂显色,双波长扫描测定了暗紫贝母、甘肃贝母和裕民贝母等12种贝母20个样品的西贝素含量,从而为贝母类生药的品质评价提供了依据。这种方法简便,结果稳定。


  2.3 气相色谱法(GC) 李松林等[9]采用柱前衍生气相色谱法,先使三甲基硅烷咪唑(TMSI)与贝母异甾体生物碱反应生成衍生物,以正三十烷为内标,对国产16种药用贝母中活性异甾体生物碱进行了分析研究,认为该方法重现性好、灵敏度高、操作较为简便。有学者还尝试采用直接气相色谱法,在Supelco SAC-5柱上,以氮气作为载体,对7种主要贝母异甾体生物碱进行定量分析,结果表明该方法较柱前衍生气相色谱法,具有耗时少、重现性高和高精密度等优点[10]。


  2.4 高效液相色谱法(HPLC)


  2.4.1 柱前衍生化HPLC法 多数贝母生物碱无共轭双键,因此单体生物碱的直接HPLC分析研究较少,仅分析过贝母药材中一个含羰基的化合物贝母辛,且检测灵敏度较低[11]。李文彦等[12]利用柱前衍生化HPLC法检测了药材中的西贝素。该法准确,检测灵敏度高,但样品预处理时间较长,衍生化试剂价格昂贵是该法的美中不足。


  2.4.2 高效液相蒸发散射法(HPLC-ELSD) 该方法解决了大多数贝母生物碱因无紫外吸收而无法直接用HPLC定量分析这一难题。流动相为乙腈10mmol/L-NH4HCO3(浓氨水调至pH 10.1)=A∶B系统,梯度洗脱,温度恒定在40℃,ELSD参数是漂移管温度85℃,氮气压力0.2MPa,增益50[13]。朱丹妮等[14]在Silica(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱上,以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1)和环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶0.12)为流动相,Alltech ELSD-500检测器检测,外标法测定了5种商品贝母中的贝母甲素和贝母乙素的含量。这种方法简便、精确,重现性也较好,但因为较高的实验设备要求而影响了它的推广。


  3 贝母碱的药理作用


  3.1 镇咳作用 平贝母为常用的止咳化痰药。李萍等[15]报道平贝母总碱部分对小鼠氨水引咳有显著或非常显著的止咳作用,其乙醇提取物亦有显著的镇咳作用。通过对生物总碱作进一步的分离提取得到西贝素,经小鼠氨水引咳和豚鼠枸橼酸引咳实验证实,这种单体成分具有显著的镇咳作用,且有用量小、毒性低的优点,是很有开发前途的天然高效止咳药。汪丽燕等[16]对贝母镇咳机制进行了初步探讨,认为贝母抑制咳嗽中枢而不抑制呼吸中枢,这对治疗慢性支气管炎并发肺气肿咳嗽者更为有利。


  3.2 祛痰作用 黏稠的痰易造成呼吸道阻塞而继发感染,并刺激呼吸道引起咳嗽,因此祛痰药的基本功用之一是使痰液变稀易于咳出[17]。徐东铭从平贝母药材中分得平贝碱甲和平贝碱苷两种单体化合物,经药理实验证明有明显的祛痰作用和降压作用[18]。
3.3 平喘作用 哮喘是由于过敏原或其他非过敏因素引起的气管和支气管对各种刺激的反应性增高而导致广泛、可逆的气道狭窄。贝母碱的平喘机制一般认为与其松弛支气管平滑肌,减轻气管、支气管痉挛,改善通气状况有关。此外,熊玮等[19]发现贝母醇提取物能明显提高小鼠常压耐缺氧能力,即能降低组织对氧的需要量,这对哮喘病人也是有利的。


  3.4 抗溃疡作用 平贝总碱对大鼠结扎幽门性溃疡、消炎痛性溃疡及应激性溃疡都有一定的抑制作用[8]。局部溃疡的形成是胃壁组织被胃酸和胃蛋白酶消化的结果,这种自我消化过程是溃疡形成的直接原因,因而平贝总碱抑制胃蛋白酶活性可能是其抗溃疡作用的机制之一。


  3.5 对心血管作用 西贝素对麻醉狗有降压作用,主要是由于外周血管扩张,对心电图无明显影响。贝母碱极少量时可使血压上升,大量可使血压下降。平贝碱甲也可使血压下降[5]。


  3.6 对平滑肌作用 西贝素对离体豚鼠回肠、兔十二指肠、大鼠子宫及整体狗小肠有明显的松弛作用,且随着浓度的增加而增加,并能对抗乙酰胆碱、组胺和氯化钡引起的平滑肌痉挛作用。其解痉作用类似于罂粟碱[18]。


  以上研究证明,平贝母确有镇咳、祛痰、平喘等良好功效。近年来,由贝母提取的总生物碱、总皂苷和单体生物碱的作用更为确切,可见贝母是很有开发前途的纯天然高效药物。综上所述,国内外对贝母化学成分及生物活性已经进行了较深入的研究[13,14,20]。今后对平贝母的研究工作既要进一步进行活性成分筛选,还应对分离得到的被证明有显著活性的单体成分进行动物体内代谢研究,这是阐明平贝母作用机制所必需的,也是开发新制剂、实现中药材现代化所必需的。


  4 平贝母的人工栽培和组织培养


  4.1 人工栽培 平贝母从种子发芽到开花结果,一般要经历6年左右的时间,而采用其鳞茎作繁殖材料,当年就可分生子贝,且数量较多,分生的子贝可作种栽培,母贝可收商品。用子贝作繁殖材料,比种子繁殖要早收2~3年。用母贝作繁殖材料,次年或第3年就可收获商品,留下分生的子贝继续生长繁殖[21]。虽然用贝母鳞茎作为繁殖材料可以将平贝的栽培时间缩短一半以上,但还是不能满足市场的需求,而且贝母的生长还需要有适宜的温度、湿度、光照和土壤等条件,病虫害的预防等比较费时、费力,栽培贝母的投资也比较大,因此近年来人们越来越多的关注利用植物组织培养技术来生产其药用成分。


  4.2 组织培养 与栽培整株植物相比,用体外培养方法生产有价值的药用成分具有以下优点:(1)代谢产物的生产完全在人工控制条件下进行,可通过改变培养条件和选择优良培养品系得到超过栽培植株产量的代谢产物;(2)培养在无菌条件下进行,可排除病虫害侵扰;(3)可以进行特定的生物转化反应;(4)可以探索新的合成路线和获得新的有用物质等[22]。


  贝母各部分取材进行组织培养都易成功,由于贝母鳞片切块再生能力强、生长迅速、取材也比较方便,所以使用最为广泛。实验证明,贝母愈伤组织及组织培养小鳞茎中含有生物碱,而且含量高于人工栽培的一倍以上,说明组织培养可有效地保持原商品药材的药用活性成分,从而可望保持应有的药效[23]。贝母鳞茎培养大多采用的是固体培养,而根据蔡朝晖等[24]报道,液体震荡培养的生长速率比固体培养的高31%,在摇床上培养的暗紫贝母鳞茎每升培养液可产生的生物碱比固体培养基高30%。尽管组织培养有许多优点,但是目前还没有投入到工业生产中。另外,愈伤组织的快速生长一般需要培养基中添加植物生长激素来维持,而有些生长激素对人体有害,如目前研究最有效的生长素2,4-D就毒害人的中枢神经系统等[22]。因此,人们在试图寻找这些有害激素的替代品的同时,也尝试用别的途径来生产贝母碱。


  5 药用植物内生真菌的分离以及用于生产相关活性产物的可能性


  植物内生真菌(endophytic fungi)是指在某一时期生活在植物体内,但对寄主植物组织并不引起明显病害的真菌[25]。有些植物与内生真菌的关系是互惠共生的,表现在一方面植物为内生真菌提供光合产物和矿物质;另一方面内生真菌的代谢能够刺激植物的生长发育,提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力[26]。


  有关植物内生真菌的研究起始于19世纪末,自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后,内生菌的研究才得以广泛的开展起来。1993年美国的Stierle等[27]从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离出200多种微生物,其中有一种内生真菌——安德紫杉菌(Taxomyces andreanae)能产生其宿主红豆杉的药用成分紫杉醇。这一研究结果引起广泛兴趣,特别是在抗癌药物生产领域。内生真菌由于其物种丰富,数量庞大,加上Stierle的最新研究结果,使内生真菌成为国内外研究的热点之一。目前,已有不少研究者从药用植物中筛选出个别内生真菌,它们能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分。1994年,北京大学邱德有等[28]从云南红豆杉(T.yunanensis)的树皮中分离出80多个内生真菌菌株,其中也有一个菌株具有产紫杉醇的能力;1999年,中山大学王伟等[29]从南方红豆杉(T.chinensis var.mairei)中分离得到87个真菌菌株,其中有6个菌株能分泌紫杉烷类化合物。云南大学李海燕等[30]分别从长春花(Catharanthus roseus)、桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)等植株中分别分离到产抗癌药物长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌;从长春花植株中分离出21株真菌,其中有4株产长春新碱类似物;从桃儿七植株中共分离得到28株真菌,其中有2株产鬼臼毒素类似物。由此可见,内生真菌有着和它的宿主植物相同或相似成分的现象可能具有普遍性。利用这些微生物通过人工发酵法生产与其宿主植物特有药用活性成分是有可能的。


  国内外从药用植物中得到的能产生与宿主类似活性物质的报道不断增多,但贝母碱生产菌的筛选尚未见报道。我们目前正在做这方面的尝试,已经从贝母中分离出内生真菌,是否可以通过发酵途径生产其药理活性物质,还需进一步的探索。如果证实可行,对相关药效成分生产新途径的开发和野生资源的保护工作将会是十分有意义的。


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  作者单位: 710069 陕西西安,西北大学生命科学学院(△通讯作者)

 

 

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